Contrôle qualité de l'ARN
Chaque lot d'ARN est quantifié, son intégrité est évaluée, et sa pureté est contrôlée avant toute expédition ou construction de banque.
La qualité de l'ARN conditionne le succès de la banque VHH.
Un ARN dégradé ou contaminé compromet directement l'efficacité de la transcription inverse et de l'amplification du répertoire VHH par RT-PCR. C'est pourquoi chaque extrait est systématiquement qualifié avant d'être validé, qu'il soit destiné à un projet de banque immune ou expédié en tant que produit ARN naïf.
Trois contrôles complémentaires, sur chaque lot.
Quantification fluorométrique
La concentration est mesurée par fluorométrie (Qubit), une méthode qui utilise un colorant se liant spécifiquement à l'ARN. Contrairement à la spectrophotométrie (type Nanodrop), elle n'est pas faussée par des contaminants absorbant à 260 nm et offre une estimation plus fiable de la concentration réelle en ARN.
Évaluation de l'intégrité
L'intégrité est évaluée par électrophorèse capillaire sur système Agilent TapeStation, qui génère un électrophérogramme du profil ribosomal (pics 18S et 28S) et calcule un score RINe (RNA Integrity Number equivalent) de 1 (ARN totalement dégradé) à 10 (ARN parfaitement intact).
Contrôle de pureté
Les ratios d'absorbance A260/280 et A260/230 sont vérifiés pour détecter d'éventuelles contaminations protéiques, phénoliques ou par des sels chaotropiques résiduels des étapes d'extraction. Une préparation pure présente des ratios compris entre 1,8 et 2,1.
Électrophérogramme d'un ARN total de haute intégrité.
Deux pics nets correspondant aux ARN ribosomaux 18S et 28S, une ligne de base plate et peu de bruit dans les basses tailles : la signature d'un ARN peu dégradé.
Seuils appliqués avant validation d'un lot.
| Paramètre | Méthode | Seuil de validation |
|---|---|---|
| Concentration | Mesure fluorométrique (Qubit) | Selon volume et usage prévu |
| Intégrité (RINe) | TapeStation | ≥ 7,0 pour construction de banque |
| Pureté A260/280 | Spectrophotométrie | 1,8 – 2,1 |
| Pureté A260/230 | Spectrophotométrie | 1,8 – 2,1 |
| Contrôle visuel du profil | Électrophérogramme | Pics 18S / 28S distincts, ligne de base plate |
Un RIN élevé, une banque VHH plus représentative.
Un score RINe supérieur à 7 est généralement requis pour une amplification fiable du répertoire VHH par RT-PCR : un ARN dégradé produit des amplicons plus courts, moins représentatifs de la diversité réelle du répertoire immunitaire, et réduit le nombre de clones fonctionnels récupérables lors du criblage par phage display.