Controlo de qualidade do ARN
Cada lote de ARN é quantificado, a sua integridade é avaliada, e a sua pureza é controlada antes de qualquer expedição ou construção de banco.
A qualidade do ARN condiciona o sucesso do banco VHH.
Um ARN degradado ou contaminado compromete diretamente a eficácia da transcrição reversa e da amplificação do repertório VHH por RT-PCR. É por isso que cada extrato é sistematicamente qualificado antes de ser validado, quer se destine a um projeto de banco imune quer seja expedido como produto de ARN naïve.
Três controlos complementares, em cada lote.
Quantificação fluorométrica
A concentração é medida por fluorometria (Qubit), um método que utiliza um corante que se liga especificamente ao ARN. Ao contrário da espetrofotometria (tipo Nanodrop), não é distorcida por contaminantes que absorvem a 260 nm e oferece uma estimativa mais fiável da concentração real de ARN.
Avaliação da integridade
A integridade é avaliada por eletroforese capilar num sistema Agilent TapeStation, que gera um eletroferograma do perfil ribossómico (picos 18S e 28S) e calcula uma pontuação RINe (RNA Integrity Number equivalent) de 1 (ARN totalmente degradado) a 10 (ARN perfeitamente intacto).
Controlo de pureza
As razões de absorvância A260/280 e A260/230 são verificadas para detetar eventuais contaminações proteicas, fenólicas ou por sais caotrópicos residuais das etapas de extração. Uma preparação pura apresenta razões entre 1,8 e 2,1.
Eletroferograma de uma amostra de ARN total de alta integridade.
Dois picos nítidos correspondentes aos ARN ribossómicos 18S e 28S, uma linha de base plana e pouco ruído nos tamanhos baixos: a assinatura de um ARN pouco degradado.
Limiares aplicados antes da validação de um lote.
| Parâmetro | Método | Limiar de validação |
|---|---|---|
| Concentração | Medição fluorométrica (Qubit) | Consoante volume e uso previsto |
| Integridade (RINe) | TapeStation | ≥ 7,0 para construção de banco |
| Pureza A260/280 | Espetrofotometria | 1,8 – 2,1 |
| Pureza A260/230 | Espetrofotometria | 1,8 – 2,1 |
| Controlo visual do perfil | Eletroferograma | Picos 18S / 28S distintos, linha de base plana |
Um RIN mais elevado, um banco VHH mais representativo.
Uma pontuação RINe superior a 7 é geralmente necessária para uma amplificação fiável do repertório VHH por RT-PCR: um ARN degradado produz amplicões mais curtos, menos representativos da diversidade real do repertório imunitário, e reduz o número de clones funcionais recuperáveis durante a triagem por phage display.